Karl Valentin wird 1882 unter dem bürgerlichen Namen Valentin Ludwig Fey im Münchner Stadtteil Au als Sohn des Tapezierermeisters und Speditionsunternehmers Johann Valentin Fey und dessen Ehefrau Maria Johanna geboren. Im selben Jahr sterben seine beiden Brüder an Diphtherie.

Nach der Schule absolviert Karl Valentin eine Schreinerlehre und arbeitet ab 1899 in verschiedenen Münchner Schreinereien. Nebenbei nimmt er Unterricht im Zitherspielen, besucht eine Varietéschule und tritt als Alleinunterhalter auf. Als sein Vater 1902 stirbt, übernimmt Karl Valentin zunächst die familieneigene Speditionsfirma, verkauft sie 1906 und zieht mit seiner Mutter nach Zittau. Er baut seinen Musikapparat, das „lebende Orchestrion“ und tingelt mit einem Soloprogramm durch Deutschland. Der Erfolg bleibt aus, 1908 kehrt er zurück nach München und wird von der Volkssängerbühne des Frankfurter Hofs engagiert.

1911 heiratet er seine langjährige Lebensgefährtin Gisela Royes, mit der er bereits zwei Töchter hat.

Kurz vor seiner Hochzeit entdeckt er im Frankfurter Hof die junge Soubrette Elisabeth Wellano, ist von ihrem Talent zur Komikerin überzeugt und macht sie zu seiner Bühnenpartnerin Liesl Karlstadt. „Im Jahr 1911 lernte ich im Frankfurter Hof meine Partnerin kennen. Ich entdeckte ihr komisches Talent, und wie sie die ersten Jahre meine Schülerin war, so wurde sie später meine Mitarbeiterin und Mitverfasserin meiner Stücke“, charakterisiert er ihre Zusammenarbeit.

Fasziniert vom Medium Film richtet sich Karl Valentin ein Filmstudio ein und dreht 1913 seinen ersten Stummfilm Karl Valentins Hochzeit. 1915 übernimmt er, zusammen mit Liesl Karlstadt, die Direktion des Kabaretts Wien-München im Hotel Wagner. Das Komikerpaar gastiert in allen wichtigen Münchner Kabaretts, u.a. im Annenhof, im Kabarett Serenissimus, im Hofbräuhaus-Festsaal, im Cabaret Benz, im Monachia am Karlstor und im Germania-Brettl.

In dieser Zeit entstehen die berühmten Szenen und Stücke wie Tingel-Tangel (auch unter dem Titel Theater in der Vorstadt, Die Orchesterprobe, Vorstadtorchester bekannt), Die Raubritter vor München, Die verhexten Notenständer, Der reparierte Scheinwerfer, Der Firmling, Im Photoatelier.

In den 1920er Jahren unternimmt das Bühnenpaar erfolgreiche Gastspielreisen nach Zürich, Wien und Berlin, über die in allen wichtigen Medien berichtet wird. Vergleiche mit Charlie Chaplin werden angestellt und von Bertolt Brecht unterstützt: „Es ist nicht einzusehen, inwiefern Karl Valentin dem großen Charlie, mit dem er mehr als den fast völligen Verzicht auf Mimik und billige Psychologismen gemein hat, nicht gleichgestellt werden sollte, es sein denn, man lege allzuviel Gewicht darauf, dass er Deutscher ist.“

Seit den 1920er Jahren nennt sich Karl Valentin „Wortsteller“. Indem er die Sprache wörtlich nimmt, sabotiert er das Gespräch und lenkt es in ungeahnte Bahnen. Es gelingt ihm und seiner Partnerin, auf der Bühne mit wenigen Sätzen und Gesten zu vermitteln, dass sie zwei Fremde in der Welt sind, ausgesetzt in einen Alltag, in dem sich außer ihnen jeder zurechtzufinden scheint. „Seine Verlegenheit ist ein Stück Ur-Verlegenheit der Kreatur darüber, dass sie da ist“, schreibt der österreichische Schriftsteller und Kritiker Alfred Polgar. Bertolt Brecht bestätigt: „Hier wird uns gezeigt die Unzulänglichkeit aller Dinge, einschließlich uns selber. Wenn dieser Mensch, eine der eindringlichsten geistigen Figuren unserer Zeit, den Einfältigen die Zusammenhänge zwischen Gelassenheit, Dummheit und Lebensgenuss leibhaftig vor Augen führt, lachen die Gäule und merken es tief innen.“

Nach den „Golden Twenties“, in denen seine Vorstellungen ausverkauft sind, verändert sich in den 1930er Jahren mit dem politischen auch das kulturelle Klima. Immer mehr Münchner Bühnen werden geschlossen. Die Zensur tut ein Übriges. Um sich davon unabhängig zu machen, eröffnet Valentin 1934 sein „Panoptikum“, den mit selbst angefertigten Kuriositäten und Absurditäten gefüllten Gruselkeller im Hotel Wagner. Doch diesem Projekt ist ebenso wenig Erfolg beschieden wie der 1939 eingerichteten Kabarettkneipe „Ritterspelunke“ im Färbergraben. Im selben Jahr trennt sich das Bühnenpaar Valentin-Karlstadt.

Während des Krieges zieht sich Karl Valentin in sein Haus in Planegg zurück und tritt nicht mehr öffentlich auf. Er lebt in großer finanzieller Not. 1947 versucht er noch einmal, zusammen mit Liesl Karlstadt, an seine Bühnenerfolge anzuknüpfen. Am 9. Februar 1948 stirbt er an einer nicht auskurierten Bronchitis mit nachfolgender Lungenentzündung.