Der Sohn eines herzoglich-württembergischen Stadtverwalters studiert in Tübingen evangelische Theologie. Zwischen 1708 und 1713 unternimmt er Reisen zu den wichtigen Zentren des Protestantismus in Deutschland, Holland und England. Er macht Bekanntschaft mit dem Theologen und Hauptvertreter des halleschen Pietismus August Hermann Francke und wird ab 1710 zwei Jahre Prediger an der Londoner Savoykirche.

1713 Pfarrer in Stetten im württembergischen Remstal, wird Urlsperger 1714 Hofprediger und Konsistorialrat in Stuttgart. Weil er in einer Bußpredigt das Verhältnis des Herzogs mit seiner Mätresse anprangert, gerät er kurzzeitig in Gefangenschaft; 1720 wird er Stadtpfarrer in Herrenberg, 1723 bis 1765 Senior und Pfarrer bei St. Anna in Augsburg.

Als einflussreichster evangelischer Theologe Augsburgs seiner Zeit und Vorsteher des Augsburger Krankenhauses zeichnet sich Samuel Urlsperger vor allem durch sein christlich-praktisches Engagement aus. Von Pietismus und Bekenntnisbewegung geprägt, setzt er sich ein für verfolgte Christen, gründet die evangelische Gemeinde in Smyrna mit, fördert die äußere Mission, die Diasporaarbeit und die Diakonie. Die Salzburger Exulanten werden aufgrund seiner Kontakte in Ostpreußen und Nordamerika (Ebenezer) angesiedelt. Auch fällt in seine Amtszeit die Renovierung von St. Anna. Insgesamt gilt Urlsperger als der wohl wichtigste Repräsentant des Pietismus im süddeutschen Raum.

Sein umfangreiches schriftstellerisches Werk zählt weit über 200 Nummern. Erhalten sind von ihm u.a. Predigten und Gebetstexte, geistliche Lieder und für die Stadt Augsburg sozialgeschichtlich aufschlussreiche Leichenreden (z.B. auf Anna Rosina Sulzer, Johann Thomas von Raumer, Johann Weidner, Johann Christoph Amman, Johann von Stetten, Martin Hieronymus Langenmantel). Daneben existieren pädagogische Vorschläge und Reformen sowie eine Autobiografie für ein Sammelwerk (1748).