Über Jakob Ayrers Herkunft und Bildungsweg ist wenig bekannt. Bis 1570 betreibt er in Nürnberg eine Eisenhandlung, danach hält er sich als Bürger und Prokurator in Bamberg auf, kehrt aber infolge seiner Ausweisung 1593 nach Nürnberg zurück, wo er ein Jahr später das Bürgerrecht erwirbt und als Prokurator am dortigen Stadtgericht wirkt. 1598 wird er Genannter des Rats, ferner übt er das Amt eines kaiserlichen Notarius aus. Um 1600 heiratet er Susanne Neukam, mit der er fünf Töchter und sechs Söhne hat, darunter den späteren Juristen Jakob Ayrer den Jüngeren.

Noch in Bamberg verfasst Ayrer eine Reimchronik Von Ankunfft, vnd Erbauung der Stadt Bamberg, deren erste Fassung bis 1570 erfolgt; eine zweite Fassung und Erweiterung wird bis 1599 fertiggestellt. Daneben entsteht eine Psalter-Übersetzung (1574), die jedoch ungedruckt bleibt. Von 1592 an entstehen mehr als 100 Dramen, Fastnacht- sowie Singspiele, von denen 69 (33 Dramen, 36 Spiele) erhalten sind. Die Erben Ayrers lassen 1618 den ersten Teil seiner Schriften, Opus theatricum, drucken und kündigen einen zweiten, nie erschienenen Band mit weiteren 40 geistlichen und weltlichen Komödien an. Drei Dramen werden nur in einer insgesamt 22 Werke umfassenden Dresdener Handschrift überliefert.

Als Dramatiker knüpft Ayrer an Hans Sachs an, den er als sein Vorbild sieht, und gilt als letzter bedeutender Autor von Fastnachtspielen. Die Bedeutung seines Œuvres liegt außerdem darin, dass viele Stücke mit z.T. ausführlichen Bühnenanweisungen versehen sind oder eine komplizierte Bühnentechnik voraussetzen. Neu sind aufwendige Kulissen und prächtige Kostüme sowie ein oft mehrere Dutzend Akteure erforderndes Personal. Von den Schauspielern der sogenannten Englischen Komödianten, die während des 16. und 17. Jahrhunderts durch wiederholte Besuche das Repertoire des Elisabethanischen Theaters nach Deutschland bringen und seit den 90er Jahren auch in Nürnberg spielen, entlehnt er die Figur des Narren Jan Posset und bürgert das Singspiel als literarische Gattung in Deutschland ein. In Nachahmung der englischen „Jigs“ schreibt er Singspiele mit wenigen Darstellern, mit Dialog in Strophen, die auf eine oder mehrere Volksliedmelodien gesungen werden.

Gleichwohl scheint Ayrer der nötige dramatische Nerv zu fehlen: Als Quellen dienen ihm vorbehaltlos Livius, Plutarch, Bibel, mittelalterliche Schwankerzählungen und Ritterromane, Boccaccio, Nicodemus Frischlin, Jörg Wickram, Hans Sachs u.a.m. Leicht verliert Ayrer sich in komischen bzw. obszönen Einzelheiten sowie Episoden; die Personen werden nach ihrem Tun moralisch beurteilt, ohne seelische Ausmalung oder Motivierung. Vor allem in seiner Comedia von der schönen Sidea und Von zweyn Brüdern aus Syracusa, die denselben Ursprung wie die Shakespeareschen Stücke Die Komödie der Irrungen und Der Sturm haben, tritt dies offensichtlich zutage. Bedenkt man aber, dass „didaktisch ausdeutbare Nebenepisoden zuungunsten der Haupthandlung eingebaut und Komik und Obszönität im Rahmen einer zum Exempel fortentwickelten motivischen Grundlage funktionalisiert“ werden, es also nicht um die Ausgestaltung von Charakteren, sondern um die „Unterhaltung des Zuschauers als Mittel zu dessen religiös-moralischer Besserung“ geht (Jens Haustein), kann man das nicht als Schwäche auslegen.

Über Aufführungen zu Ayrers Lebzeiten ist nichts bekannt. Seine Produktion steht neben der historischen Entwicklung als persönliches Kuriosum ohne Auswirkung. Allerdings wird seine Comedia von der schönen Phaenicia wiederum Quelle für das „Mischspiel“ Die vom Tode erweckte Phönizia (1680) des Barockdichters Michael Kongehl.