1746 geboren und aufgewachsen im thüringischen Städtchen Langewiesen an der Ilm, wo sein Vater Organist, Stadtschreiber und Bürgermeister ist, besucht Johann Jakob Wilhelm Heinse im Alter von 14 Jahren das Gymnasium in Arnstadt. 1762 wechselt er auf das Hennebergische Gymnasium zu Schleusingen, wo bereits erste literarische Arbeiten Heinses entstehen. Ein auf die Schulzeit folgendes Studium der Jurisprudenz in Jena schließt Heinse nicht ab; er wechselt 1768 an die Universität Erfurt und lernt dort Christoph Martin Wieland kennen, der ihn an Johann Wilhelm Gleim empfiehlt. Doch schon 1771 muss er die Stadt verlassen und begibt sich auf eine Reise nach Süddeutschland: Auf der Suche nach einem Unterkommen wird er Reisebegleiter zweier Offiziere, danach tritt Heinse eine von Gleim vermittelte Hofmeisterstelle bei der Familie von Massow an, bis er sich ab 1773 nach Halberstadt zu Gleim begibt. In diesen Jahren entsteht neben der Petronius-Übersetzung und anderen Übertragungen Heinses erstes umfangreiches literarisches Werk, der Roman Laidion oder die Eleusinischen Geheimnisse (1774).

Im April 1774 wird Heinse Mitherausgeber der Damenzeitschrift Iris der Brüder Jacobi in Düsseldorf. Zusammen mit Friedrich Heinrich Jacobi lernt er Goethe kennen (Juli 1774), was für seine Selbstfindung von zentraler Bedeutung wird: an die Stelle des vernünftig-heiteren Daseinsgenusses der Aufklärung tritt nun die „stürmische“, die Grenze des Ichs sprengende Lebensfreude. Seine anti-klassizistische Kunstauffassung legt Heinse bereits in den Briefen Über einige Gemälde der Düsseldorfer Galerie (1776/77) nieder, schließlich erfüllt er sich seinen Lebenstraum und reist – überwiegend zu Fuß – nach Italien.

In Rom lernt er den Maler Friedrich Müller kennen, der ihn mit der Geschichte und Kunst der Stadt vertraut macht. Heinse übersetzt Werke von Tasso und Ariost, vor allem aber bildet er seine neue Kunstauffassung aus, die er in zahlreichen Briefen und Notizen festhält. Nach seiner Rückkehr nach Deutschland 1783 schreibt er sein Hauptwerk, den Roman Ardinghello und die glückseeligen Inseln, der in zwei Bänden 1786/87 erscheint. Als erste literarische Gestaltung der Renaissance und zugleich Muster vieler späterer Künstlerromane geht dieser Roman in die Literaturgeschichte ein. Sein Held Ardinghello ist der „ganzheitliche“, der zeitgleichen Bewegung des Sturm und Drang nahestehende Genuss-, Tat- und Kraftmensch, der allerlei Abenteuer besteht und dem in Fiordimona eine Art weibliches Pendant zur Seite gestellt wird. Bei den Zeitgenossen erregt Ardinghello großes Aufsehen; allein die mit dem Kunst-„Genuss“ gleichgesetzte sexuelle Freizügigkeit stößt in der beginnenden Weimarer Klassik auf Widerwillen. Die Romantiker, Hölderlin und das Junge Deutschland schätzen den Roman ob seines emanzipatorischen Künstlertums hingegen sehr. Das neuartige literarische Verfahren, die Erzählhandlung als Illustration seiner Ideen und Anschauungen zu nutzen, bringt Heinse in seinen späteren Romanen in noch extremerer Form zur Anwendung – in Hildegard von Hohenthal (1795/96) sind es die Ausführungen zur Oper bzw. Musik, in Anastasia (1803) ist es das Schachspiel.

1786 wird Heinse Vorleser beim Mainzer Erzbischof und Kurfürsten Friedrich Karl von Erthal, der ihn zum Hofrat und Professor ernennt, bald darauf Bibliothekar. Während der französischen Besetzung 1792/93 weilt er mit Freunden am Niederrhein, wo er auch Goethe wiedertrifft. Bei der Belagerung von Mainz im folgenden Jahr folgt Heinse Erthal in die erzbischöfliche Zweitresidenz Aschaffenburg und verfasst im Auftrag seiner Gönnerin Sophie von Coudenhove eine polemische Schrift gegen die französische Revolution und ihre deutschen Anhänger, Über die französischen Drakonen (1793). Ende 1794 muss er mit der kurfürstlichen Bibliothek schließlich ins Aschaffenburger Schloss übersiedeln.

Die letzten Lebensjahre verbringt Heinse zum Großteil in der von ihm betreuten Bibliothek. Daneben beschäftigt er sich, durch seinen Freund Samuel Thomas Soemmering angeregt, mit anatomischen Fragen und erforscht den Beginn der Buchdruckerkunst. Den Kriegsunruhen ausweichend, unternimmt er im Sommer 1796 zusammen mit Susette Gontard, der Freundin von Soemmerings Frau, und Hölderlin eine Reise nach Kassel und Bad Driburg. Diese beeindruckt den jungen Hölderlin so tief, dass er seine programmatische Elegie Brod und Wein (1800/01) Heinse widmet.

Am 27.6.1802 erleidet Heinse einen Schlaganfall, dem eine einseitige Lähmung folgt. Nachdem ihn im Juni 1803 ein zweiter Schlaganfall trifft, stirbt er in Aschaffenburg und wird am 24.6.1803 auf dem Agathenfriedhof beigesetzt.