Der einem alteingesessenen Nürnberger Patriziergeschlecht entstammende Harsdörffer studiert von 1623 an in Altdorf Jura, Philosophie, Philologie, Mathematik und Naturwissenschaften, ab 1626 in Straßburg; spätere Briefpartner wie Johann Michael Moscherosch und Jesaias Rompler von Löwenhalt lernt er womöglich hier schon kennen. Seine Bildungsreise, die er 1627 zusammen mit dem zukünftigen Ratsherrn, Dichter und Präses des Pegnesischen Blumenordens Christoph Fürer unternimmt, führt ihn über die Schweiz, Frankreich, die Niederlande und England nach Italien, wo Harsdörffer romanische Sprachen erlernt. Die gepflegte Muttersprachlichkeit dieser Länder wird ihm schnell zum Vorbild. Nach seiner Rückkehr wirkt Harsdörffer nach kurzer diplomatischer Tätigkeit ab 1634 als Assessor am Nürnberger Untergericht, von 1637 bis 1655 am Stadtgericht und bis zu seinem Tode als Mitglied des Inneren Rats der Stadt.

Von besonderer Vielseitigkeit ist sein Werk: Harsdörffer publiziert, häufig unter Pseudonym, über 30 voluminöse Schriften, er übersetzt, bearbeitet, ergänzt bzw. sammelt weltliche und geistliche Werke der west- und südeuropäischen Literatur und steht im regen Briefwechsel mit vielen anderen Autoren seiner Zeit, darunter auch Mitgliedern verschiedener Sprachgesellschaften (Rist, Schottel, Moscherosch, Birken, Zesen). Neben einer Poetik (Poetischer Trichter, 1648-53), in der er die sprachlichen Mittel darlegt, die vom kunsthandwerklich arbeitenden Poeten verwendet werden sollen, stammen von ihm eine Sprachtheorie (Specimen Philologiae Germanicae, 1646), ein Briefsteller (Der teutsche Secretarius, 1656), eine Abhandlung über die Naturwissenschaften (Delitiae mathematicae et physicae, 1654) sowie Sammlungen unterhaltender wie belehrender Erzählungen, darunter Nathan und Jotham (1650), Der Grosse Schau-Platz Lust- und Lehrreicher Geschichte (1650/51) und Der Grosse Schau-Platz jämmerlicher Mordgeschichte (1656). In den ebenfalls von Harsdörffer unter dem Namen „Der Spielende“ abgefassten (Frauenzimmer) Gesprechspielen (8 Bde., 1641-49) werden im Dialog fingierter Personen u.a. Probleme der Sprache und Literatur erörtert, Literatur verschiedenster Formen produziert und barocke gesellige Bildung und Formkultur vermittelt. Darüber hinaus enthalten sie ein Programm seiner ‚Friedensarbeit‘: Vermittlung von „Weltkenntnis, Förderung von Urteils- und Willensbildung für ein friedliches freundlich-gesittetes, politisch und sozial geordnetes, tolerantes, weltbejahendes, doch tugendhaft gottgefälliges Leben“. (Irmgard Böttcher)

Um die Pflege der deutschen Sprach- und Dichtkunst macht sich Harsdörffer besonders verdient, die naturnachahmende Klangmalerei wird ihm ein wichtiges Ausdrucksmittel seiner Dichtung. 1644 gründet er zusammen mit Johann Klaj nach norddeutschen Vorbildern in Nürnberg den Pegnesischen Blumenorden, dessen Vorsitz er übernimmt – vorausgegangen ist seine Aufnahme in die Fruchtbringende Gesellschaft (1642) bzw. in die Teutschgesinnte Genossenschaft von Philipp von Zesen (1643). Mit dem gemeinsam verfassten Pegnesischen Schäfergedicht (1644/45), einer Festdichtung für eine Doppelhochzeit im Stile von Opitz' Hercinie, begründen die Nürnberger „Pegnitzschäfer“ Klaj, Harsdörffer und Birken nicht nur ihren eigenen Blumenorden, sondern unterstreichen zugleich ihre Neigung zur Schäferdichtung.

Seine geistlichen Lieder hat Harsdörffer außerhalb seines eigenen Œuvres in den Erbauungsschriften und Gesangbüchern des mit ihm befreundeten Nürnberger Pfarrers Johann Michael Dilherr und im Nürnberger Gesangbuch von 1677 veröffentlicht. Der Text zur ältesten überlieferten deutschen Oper, das von Sigmund Theophil Staden vertonte geistliche Schäferspiel Seelewig, ist in den Gesprechspielen enthalten. Für barocke Meister wie Hofmannswaldau, Zesen, Rist, Grimmelshausen, Abraham a Santa Clara u.a. von großem Einfluss, erfährt Harsdörffer vor allem durch die Romantiker wie Clemens Brentano eine neue, infolge seiner geschliffenen Sprache und „Vernunft-Kunst“ bis heute andauernde Würdigung.