Das genaue Geburtsdatum des aus Mindelheim stammenden Humanisten und Theologen Johannes Altenstaig ist nicht bekannt, es wird um 1480 vermutet. Gesichert ist, dass am 27. Juli 1497 seine Immatrikulation an der Hohen Schule in Tübingen erfolgt. Nachdem er einige akademische Grade erworben hat, beginnt hier auch seine erste Lehrtätigkeit. Dem von ihm verehrten Lehrer in Poesie und Rhetorik Heinrich Bebel (1472-1518) widmet er sein lateinisches Wörterbuch Vocabularius vocum (zunächst 1508, dann mehrfach nachgedruckt). 1509 wird Altenstaig Lehrer am Augustinerstift in Polling (Oberbayern) und unterrichtet lateinische Grammatik, Rhetorik, Logik und Albertus Magnus‘ Naturphilosophie. Für die dortigen Mönche bestimmt er seine Schriften Opus pro conficiundis epistolis (1512) und Dialectica (1514).

Nach der Priesterweihe 1511 kehrt er in seine Heimatstadt Mindelheim zurück. Johannes Altenstaig wird – wie später auch sein Neffe Adam Reißner – von den Mindelheimer Stadtherren, der Familie von Frundsberg, durch ein Benefizium (Messpfründe) mäzeniert. Bis zu seinem Tod ist er Kaplan am St. Sebastiansaltar der Mindelheimer Pfarrkirche St. Stephan und unterrichtet zugleich am Augustinerkloster. In seiner freien Zeit widmet er sich wissenschaftlichen Arbeiten. Im Jahr 1518 führt er im Auftrag seines Tübinger Studienkollegen, des Bischofs Christoph von Stadion, eine Visitationsreise durch die bayerischen Gebiete der Diözese Augsburg durch. 

Johannes Altenstaig ist ein Mann, der weder als Wissenschaftler noch durch seine Schriften eine große Wirkung oder Bekanntheit erlangt. Er steht jedoch beispielhaft für die große Zahl humanistischer Gelehrter, die sich für die Durchsetzung des Gedankens freier Forschung auch in Religion und Theologie einsetzen. Mit namhaften Humanisten und Theologen wie Johannes Eck, Matthias Kretz, Johannes Alantsee und Nikolaus Ellenbog steht Altenstaig in freundschaftlicher Verbindung, was Briefe und Widmungen dokumentieren. 

Die Reformation lehnt Altenstaig ab. Er teilt aber die von Bebel geübte Kritik an der Geistlichkeit, was auch aus seinem Kommentar zu Bebels allegorischem Epos Triumphus Veneris hervorgeht. Wie Bebel strebt Altenstaig die Veredelung der damals recht verwilderten lateinischen Sprache an. Eines seiner Hauptanliegen ist die wissenschaftliche Bildung der Mönche und die Orientierung an den klassischen Autoren. Altenstaigs Schriften sind typische Kompilationen, vor allem Wörterbücher und Anthologien. 

In der Ausstellung „Gelehrtes Schwaben“ 1990 in der Zentralbibliothek der Universität Augsburg wird auch das Leben und Wirken des bescheidenen Theologen und sein Beitrag zur Geschichte des Humanismus in Schwaben gewürdigt. 

Der im Stadtarchiv Mindelheim verwahrte literarische Nachlass Altenstaigs umfasst einige Blätter mit Gedichten, Aphorismen und eine autobiographische Skizze sowie zwei Widmungen, davon eine an Bischof Christoph von Stadion und eine an Georg I. von Frundsberg.